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實驗室常用菌種保存方法

發布:2022-09-14 閱讀:35

菌種作為一項重要的生物資源,微生物的生產、鑒定、教學和科中廣泛使用。菌種保存方法因微生物的不同而異。在菌種保存過程中,必須使微生物的代謝處於最不活躍或相對靜止的狀態,在保存期內不發生變異保持生低溫、幹燥隔絕空氣使微生物代謝能力降低,人們常常依據這三個因素設計菌種保存方法。

菌種保存方法有多種,最理想的為真空冷凍幹燥法,具有保存時間長、成活率高、變異小等優點真空冷凍幹燥法操作技術難度大,花費高,需特殊設備,不易實施。其他一些常規方法,常因傳代次數多、易汙染、易變異,給保存帶來諸多不利。因此,選擇簡便而行之有效的菌種保存方法,延續菌種的生物穩定及生物活性,是微生物工作者必須考慮的問題。目前,中小型實驗室常用的菌種保存方法如下:

一、4℃冷藏

1.液體石蠟保存法

先將液體石蠟滅菌,然後放於37℃恒溫箱中,使水汽蒸發掉備用。再將需要保存的菌種在最適宜的斜麵培養基中培養,用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟,注入已長好的斜麵培養基上,用量以高出斜麵頂端1cm為準。試管需直立,置4℃或室溫下保存,一般無芽胞細菌可保存1年左右。

2.高層半固體瓊脂石蠟保存法

將需保存的菌種經平板劃線分離後,挑單個菌落用接種針反複穿刺接種到高層半固體瓊脂培養基中,經37℃12小時培養後取出,用無菌操作將滅菌的液體石蠟滴加半固體瓊脂菌種管表層約0.5cm高度,存放4℃冰箱,1年轉種1次。

3.蒸餾水保存法

取滅菌蒸餾水6-7mL加於試管斜麵上,用吸管研磨,洗下菌苔充分混勻,將此菌液分裝於滅菌的螺旋小瓶中,或用膠塞密封,置4℃保存可存活數年。

二、-20℃及以下溫度冷凍

1.甘油保存法

甘油生理鹽水保存液的製備:取甘油(分析純)8份加入生理鹽水2份,充分混合後,經121.3℃ 30分鍾滅菌備用。

將純化後的菌株根據菌種不同分別劃線接種於其最適宜生長的培養基上培養後,用接種針取典型菌落接種肉湯管37℃培養6-8小時(鏈球菌和奈瑟氏菌接種血清肉湯管,5-10%CO2環境下8-10小時培養,真菌直接用接種環取菌洗入肉湯管,不培養)。此為培養液。

將此培養液與保存液以5:2的比例混合分裝於滅菌的微量離心管,置-20℃冰箱保存(鏈球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用時需37℃水浴中快速解凍。

用上述方法保存一般菌株可存活3年以上,鏈球菌可存活12-15個月,且性狀未發生變異。此方法采用幼齡肉湯培養物效果好,且適用於鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種。

2.低溫保存法

菌種保存液的配製:K2HPO412.6g,檸檬酸鈉0.98g,MgSO4·7H2O 0.18g,KH2PO43.6g,甘油88g加蒸餾水至1000ml,103.4KPa滅菌30分鍾,4℃保存備用。細菌接種於肉湯培養基中,37℃培養16-18小時,或斜麵培養物刮取於生理鹽水中,然後加入等體積的菌種保存液,凍存於-70℃或-20℃冰箱中。

此方法也適合甲鏈、肺球、流感杆菌、百日咳杆菌、綠膿杆菌等耐受力低的細菌。-70℃保存10年以上,-20℃可保存2年以上。

3.細菌濕種牛奶凍存法

新鮮牛奶或15%奶粉煮沸,冷卻脫脂,分裝小試管,每管1mL,8磅15分鍾滅菌備用。

將純種菌接種於平板,37℃16小時培養,以接種環刮取菌苔2-3環於牛奶中混勻,試管用矽膠塞,凍存於普通冰箱冷凍室(-12℃-18℃)。使用時取出室溫溶解,待部分溶解時即可取一環接種平板,並將試管再迅速凍存,這樣可反複使用3-5次。此法一般菌株可存活48個月,少數如奈瑟氏菌、甲鏈、白喉等可存活14-30個月。

4.甘油原液保存法

將各待保存的菌種純化後用接種環直接從平板上刮取,置於盛有0.5mL甘油原液的菌種瓶中,-20℃保存,可連續52個月存活良好。

此法尤其適合乙鏈、破傷風杆菌、產氣莢膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌種,是一種簡便實用的有效保存方法。

5.脫纖維羊血

無菌抽取羊頸靜脈血後,沿瓶壁注入無菌的帶玻璃的三角燒瓶中,同時立即同一方向振搖約8-10分鍾,脫去纖維,然後分裝加蓋無菌小試管中約1.0-1.5mL。

將腦膜炎雙球菌、淋球菌、甲乙型鏈球菌、肺炎雙球菌分別接種於血平板培養基中,前兩者置於5-10% CO2燭缸內,經35℃16-18小時培養,後三者置37℃恒溫箱培養24小時,然後無菌操作取一接種環菌苔移種於上述新鮮脫纖維羊血試管中,立即置-3O℃冰凍保存二年轉種一次。用時室溫自然冰融即可接種。

6.紙片法

新華定性濾紙剪成4mm×4mm,1.5mL帶蓋離心管消毒滅菌備用,用消毒小鉗子鉗上濾紙片於平板上刮取待保種的純菌落2-3個。放於離心管內塞蓋再用封口膠布將蓋邊緣封好放於-30℃冰箱保存。保存12個月後取出菌種解凍後用無菌鉗取一片放於肉湯管內37℃培養12小時後轉種血平板,性狀未變異。

7.奶粉液菌種保存法

菌種保存液:脫脂奶粉10g,NaC1 10.5g,加雙蒸水100mL,121℃5分鍾高壓滅菌後分裝於1mL帶蓋無菌標本杯中(0.5mL)備用。無菌操作用4mm×10mm無菌濾紙條蘸取新鮮菌少許,放存含奶粉液保存杯中,蓋好,封口膠封口,-56℃低溫保存。3年存活率達99.2%。使用時將標本杯取出,不等全部融化,上層有少許融化即用接種環取一少許接種於血平板分離即可。

三、菌種保存注意事項

1.保存菌種須選擇生長期幼齡培養物,製成濃菌液保存,以保證存活率。

2.半固體培基最好選擇不含或含糖量低的培基,可減少或避免因代謝產物產生而造成的細菌死亡。

3.將菌種置於保存溫度下,切忌反複凍融。

4.菌種保存不僅要求存活還要求生物學性狀、生理特性、抗原性等方麵不發生變異。

5.菌種必須妥善保存保管,確保使用安全。


 


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